Volver a la lista
El inmunoensayo es un método que utiliza el principio de reconocimiento y unión de alta selectividad y alta especificidad entre anticuerpos específicos y antígenos o haptenos para analizar y determinar anticuerpos o antígenos de interés. El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (en adelante, ELISA) es un tipo de inmunoensayo que consta de tres partes: reconocimiento inmunológico, salida de señal y procesamiento de datos.
El reconocimiento inmunológico consiste en recubrir anticuerpos sobre una placa de 96 pocillos fabricada de poliestireno, y luego utilizar los anticuerpos para reconocer el antígeno de interés (generalmente biomarcadores proteicos de enfermedades, virus, bacterias, etc.), adsorbiendo el antígeno desde la solución compleja de muestra sobre la superficie de la placa de 96 pocillos. A continuación, se utilizan anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano picante (Horseradish Peroxidase, HRP), fluorescencia o radiactividad para emitir la señal de reconocimiento de forma directa o indirecta. Finalmente, utilizando la intensidad de la señal y la información del gradiente de concentración de las muestras estándar, se calcula la concentración del antígeno diana en la muestra problema.
Según las diferencias en el reconocimiento inmunológico y el modo de salida de señal, el ELISA se puede clasificar en método sándwich de doble anticuerpo, método de inmunocompetencia directa y método de inmunocompetencia indirecta, entre otros. De ellos,el método sándwich de doble anticuerpoes el más común.
el método sándwich de doble anticuerpo
①: Recubrimiento con anticuerpos Se recubren anticuerpos sobre la placa de 96 pocillos. Dado que la placa de microtitulación está fabricada de poliestireno, sus anillos bencénicos y los residuos de aminoácidos de los anticuerpos poseen una fuerza de atracción similar a la interacción de apilamiento π-π, que junto con las interacciones electrostáticas e hidrofóbicas permite adsorber los anticuerpos sobre su superficie. Después, tras lavar con tampón los anticuerpos no adsorbidos, se añade una solución de bloqueo que contiene gelatina o albúmina de suero bovino (Bovine Serum Albumin, BSA) para bloquear las zonas de la placa de microtitulación que no han unido anticuerpos. El propósito de añadir la solución de bloqueo es evitar que otras proteínas se adsorban sobre la placa de 96 pocillos por interacciones electrostáticas o hidrofóbicas, generando señales falsas positivas que interfieran con el desarrollo del experimento posterior.
②: Reconocimiento inmunológico Tras recubrir la placa de 96 pocillos con anticuerpos, se añade la muestra problema y se incuba a 37 °C durante un período de tiempo, generalmente de 1 a 2 horas. En este momento, los anticuerpos sobre la placa de microtitulación reconocen y se unen específicamente al antígeno de interés. Aquí la calidad del anticuerpo es clave: un buen anticuerpo debe unirse al antígeno de manera específica y eficiente, sin verse afectado por otros componentes de la muestra problema como macromoléculas biológicas, proteínas y sales inorgánicas.
③: Lavado de la placa Se lavan los antígenos no unidos, se añade el anticuerpo de reconocimiento correspondiente a dicho antígeno y se continúa incubando a 37 °C durante 1-2 horas; a continuación, se lavan los anticuerpos que no se han unido al antígeno.
④: Salida de señal enzimática Se añade un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante (Horseradish Peroxidase, HRP) para unirse al anticuerpo estándar. Tras 30 minutos de incubación, se lavan los anticuerpos secundarios no unidos y se añade el reactivo de coloración para revelar el color. La concentración del antígeno se determina según el resultado de la coloración. Generalmente se considera que la concentración del antígeno presenta una correlación positiva con la intensidad de luminiscencia tras la coloración.
Método de inmunocompetencia
Tomando como ejemplo la competencia entre antígenos por el anticuerpo, en el segundo paso del procedimiento del método sándwich inmunológico descrito anteriormente, tras añadir el antígeno de interés, se añade inmediatamente el antígeno marcado con enzima para que compita con el antígeno de interés por el reconocimiento del anticuerpo sobre la placa de microtitulación. Cuanto mayor sea la concentración del antígeno de interés, menor será la cantidad de anticuerpo marcado con enzima que pueda unirse al anticuerpo sobre la placa de microtitulación y, por tanto, menor será la señal emitida. De este modo, la concentración de la muestra problema presenta una correlación inversa con la señal de coloración enzimática.
